腦缺血的觀察及腦缺血模型的評價方法

缺血性腦血管疾病是一個復(fù)雜的病理生理過程，評價腦缺血的指標(biāo)各種各樣，研究中選取何種指標(biāo)評價腦缺血的程度及藥物的療效尤為重要，現(xiàn)將主要的參考觀察指標(biāo)綜述如下。

1.神經(jīng)癥狀及體征的評價

腦損傷后出現(xiàn)相應(yīng)的癥狀與體征，癥狀與體征的檢測又可以反映腦損傷與恢復(fù)的程度。常見的分級方法有：Bederson三級法、改良的Bederson、Zealonga 5分制評分法、 Tatlisumak 6分制評分法等。

常用的Bederson按受損程度分級，正常(0級)：①未見活動異常，大鼠被提尾懸空時兩前肢向地面伸直。②置動物于軟塑料板上，輕握鼠尾，在鼠肩后施加側(cè)向推力使鼠滑動約10cm，手感左右推動阻力相等；中度(1級)：①大鼠被提尾懸空時，腦缺血對側(cè)前肢呈屈曲、抬高、肩內(nèi)收、肘關(guān)節(jié)伸直等。②基本同0級；重度(2級)：①同1級。②檢查方法同上，但缺血半球?qū)?cè)的側(cè)向推動阻力明顯降低。

Zealonga的5分制評分標(biāo)準(zhǔn)為：0分，無神經(jīng)損害的癥狀；1分，不能伸展對側(cè)前爪；2分，向外側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分，向?qū)?cè)傾倒；4分，不能自發(fā)行走，意識喪失。

癥狀與體征的檢測方法直接、簡便，從整體上反映損傷程度，不需要特殊儀器，但人為心理因素比較多，只需隨機(jī)測定，可靠程度低，可以用做初步篩選或輔助性指標(biāo)。

2.定位記憶能力的評價

記憶是復(fù)雜的生理過程，在多重記憶系統(tǒng)中不同記憶系統(tǒng)有著不同的功能定位、神經(jīng)環(huán)路、遞質(zhì)系統(tǒng)和分子生物學(xué)機(jī)制。鼠腦缺血后伴有不同程度記憶力與空間定位的障礙，檢測的方法可采用：跳臺實(shí)驗(yàn)、避暗實(shí)驗(yàn)、定向游泳實(shí)驗(yàn)、 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)等。

3.腦電圖(EEC)

EEC提供了一種非創(chuàng)傷性研究腦的電活動，可以反映阻斷動脈的缺血區(qū)與非缺血區(qū)以及對側(cè)相應(yīng)部位的腦電變化，通過生物電的角度從整體上分析腦損害與腦電圖的關(guān)系。在大鼠冠狀縫前相當(dāng)于皮質(zhì)感覺運(yùn)動區(qū)(額頂區(qū))部位和頂葉后部(頂枕區(qū))的左右兩側(cè)對稱地分別放置腦電極各一個，電極穿過顱骨接觸硬腦膜，用牙科黏合劑固定，參考電極安置在鼻骨正中。八道生理記錄儀記錄。若應(yīng)用腦電圖儀，可放置更多的電極，更能準(zhǔn)確地反映腦缺血的范圍及其程度。缺血區(qū)腦電圖出現(xiàn)波幅降低，頻率減慢。

EEC檢測雖然易受外界條件的干擾，但它敏感、價廉、創(chuàng)傷少，故仍不失為一種比較好的檢測方法。

4.腦梗死面積及含水量測定法

(1)梗死面積測定  實(shí)驗(yàn)證明大鼠動脈阻塞后3～4h梗死就可以達(dá)到大范圍，測定腦梗死的面積，應(yīng)在術(shù)后4h以后進(jìn)行。做腦切片，采用TTC(氯化三苯基四氮唑)染色顯示梗死的腦組織(粉紅色區(qū)為正常腦組織，白色為梗死區(qū))。梗死腦組織的測定方法可有：①應(yīng)用透明紙描敘出每個切面兩面的外輪廓及梗死區(qū)。②應(yīng)用坐標(biāo)法、落點(diǎn)求積法等測量每片梗死區(qū)截面積和全腦截面積，計(jì)算梗死面積百分比。③可采用數(shù)碼相機(jī)拍照，輸入計(jì)算機(jī)，用圖像處理軟件計(jì)算梗死面積。④梗死范圍法：染色后，將白色腦組織挖下稱重，以梗死組織的質(zhì)量占總腦質(zhì)量百分比作為腦梗死范圍。

本方法客觀簡便，但是敏感度不高，肉眼觀察值誤差比較大，梗死區(qū)域的界限難以地確定。

(2)腦含水量測定  腦水腫是腦缺血不可避免的后果，早期腦水腫的減輕與控制可明顯地降低死亡率與致殘率，因此腦水腫的機(jī)制在不同缺血模型中被廣泛地檢測與研究。檢測的方法有：①直接法：斷頭取腦，分別稱量左右腦片濕重，烘烤至恒重，按腦水腫公式計(jì)算。②間接法：采用光鏡與電鏡觀測腦水腫組織、細(xì)胞與正常的腦組織、細(xì)胞的差別，以反映腦水腫的程度。

公式1  含水量＝[(濕重－千重)/濕重]×100％

公式2  含水量的變化＝[(右腦含水量－左腦含水量)/左腦含水量]×100％

本測定方法操作簡單，能夠客觀地反映腦水腫的程度，與面積法相互結(jié)合使用更佳。

5.軟腦膜微循環(huán)觀察

此法可以直接觀察軟腦膜微循環(huán)血液的灌流狀況，結(jié)合的微循環(huán)圖像處理系統(tǒng)可直接測量微血管的管徑及血流速度。方法為在大鼠顳頂部制作顱窗(顱窗的大小因動物種類不同而不同：犬10mm×15mm，家兔6mm×10mm，大鼠4mm×8mm)，用骨蠟及電熱燒灼器止血，無菌生理鹽水沖洗，待無出血點(diǎn)后，剪開硬腦膜，暴露軟腦膜。窗口用制備成顱窗大小及形狀的玻片覆蓋，牙科水泥封閉周圍間隙，待變硬后用手術(shù)刀將多余的部分切去。若顱窗周圍無滲出、窗內(nèi)無氣泡與出血、腦血管無異常，表示顱窗制作成功。將實(shí)驗(yàn)動物置于微循環(huán)儀下，可觀測到清晰的軟腦膜微血管圖像，通過攝像、錄像或照片記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，亦可用計(jì)算機(jī)微循環(huán)圖像處理系統(tǒng)，準(zhǔn)確地測量微循環(huán)的各項(xiàng)指標(biāo)。還可應(yīng)用激光多普勒微循環(huán)血流分析儀，將激光探頭固定于顱窗上，只要激光探頭在整個實(shí)驗(yàn)過程中無位置移動及轉(zhuǎn)動，即可準(zhǔn)確的測定該部位的微循環(huán)血流量。

6.微透析結(jié)合液相色譜

微透析(microdialysis)是一種自生物活體內(nèi)進(jìn)行動態(tài)微量生化取樣的新技術(shù)。但由于微透析樣品體積小，難以進(jìn)行前處理濃集，而各種生化物質(zhì)的含量又很低，因而給樣品測定帶來了困難。目前由于毛細(xì)管電泳儀技術(shù)的提高，能夠檢測采集的樣品，使微透析技術(shù)日臻完善。應(yīng)用微透析儀的方法為：在活體狀態(tài)下，將動物置于立體定向儀上，在前囟右側(cè)前、側(cè)各1.5mm插入微透析探針，深度3.5mm(或感興趣局域)。用灌流液灌流，速度2μl/min，基礎(chǔ)灌流60min后收集微透析液。與液相色譜或毛細(xì)血管電泳儀連用，動態(tài)觀測腦組織神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)內(nèi)分泌激素等活性物質(zhì)的動態(tài)變化。

7.電化學(xué)方法

可采用對pH、離子以及其他物質(zhì)敏感的電化學(xué)電極，利用立體定位儀直接放置在感興趣區(qū)域，動態(tài)觀測上述各指標(biāo)的變化。如采用一氧化氮敏感電極結(jié)合電化學(xué)檢測技術(shù)，觀察電針對MCAO大鼠缺血側(cè)紋狀體一氧化氮釋放的影響等。

8.腦毛細(xì)血管通透性

大鼠按50mg/kg體重的劑量靜脈注射1％伊文斯藍(lán)，之后結(jié)扎大鼠雙側(cè)CCA。結(jié)扎后3h，斷頭取腦。將腦放入盛有5ml的甲酸胺溶液試管中浸泡，并置于45℃恒溫箱中溫

育72h。取出后用721分光光度計(jì)于620μm進(jìn)行浸出液比色，測定光密度值。再以標(biāo)準(zhǔn)曲線查出5ml甲酸胺液中伊文斯藍(lán)含量，繼而計(jì)算出單位腦重的伊文斯藍(lán)含量。以此評價毛細(xì)血管通透性。

9.血管活性物質(zhì)及其他生物活性物質(zhì)的測定

在腦缺血的情況下，線粒體氧化代謝障礙，不能提供足夠的電子，且抗氧化系統(tǒng)被抑制，使含有不配對電子的自由基大量產(chǎn)生，超過機(jī)體的清除能力而造成損傷。因此測定脂質(zhì)過氧化物(LOP)可以直接反映損傷的變化，測定氧自由基的清除劑超氧化物歧化酶(SOD)以及氧自由基攻擊生物膜的多不飽和脂肪酸形成的脂質(zhì)過氧化物丙二醛(MDA)能間接反映出細(xì)胞的損傷程度。可以通過化學(xué)發(fā)光法、自氧化法、熒光法、TBA比色法等進(jìn)行測定。

氧自由基在各種損傷、應(yīng)激、感染中都可以出現(xiàn)變化，故缺乏檢測的特異性和針對性，但它是機(jī)體反應(yīng)的一種敏感指標(biāo)，故可以作為急性期的輔助指標(biāo)。

10.形態(tài)學(xué)指標(biāo)法

(1)石蠟切片  HE染色觀察：主要用于顯示各種組織正常成分和病變的一般形態(tài)結(jié)構(gòu)，進(jìn)行的觀察。普通的 HE染色光鏡下就可以觀測到梗死區(qū)間質(zhì)內(nèi)大小不等的空泡、血管擴(kuò)張、腦組織水腫，部分神經(jīng)細(xì)胞核固縮、深染，部分神經(jīng)細(xì)胞溶解、胞漿疏松、細(xì)胞界限不清，壞死區(qū)周邊可見嗜中性粒細(xì)胞。電鏡分辨率比較高，可觀察腦神經(jīng)細(xì)胞缺血后的微血管狀態(tài)、膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)、神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)、線粒體的變化等。還可以應(yīng)用示蹤技術(shù)進(jìn)行定位。

(2)免疫組化法  應(yīng)用標(biāo)記的抗體對細(xì)胞或組織內(nèi)相應(yīng)的抗原進(jìn)行定位、定性或定量檢測。經(jīng)組化顯色后，用顯微鏡、熒光、電子顯微鏡觀察。凡是能作為抗原、半抗原的物質(zhì)如C-jun蛋白表達(dá)、cycline-D蛋白表達(dá)、MAP-2等腦缺血損傷相關(guān)蛋白均可以應(yīng)用免疫組化準(zhǔn)確定位。根據(jù)標(biāo)記物的性質(zhì)，可將免疫組化染色法分為：①免疫熒光法；②免疫酶法。③免疫金銀法。④ABC法等。根據(jù)染色及抗體滴加步驟，分為直接法、間接法、橋法等。其結(jié)果除了在光鏡下觀察外，也可以輸入醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像處理，檢測陽性細(xì)胞的平均灰度值。

免疫組化法在細(xì)胞、染色體或亞細(xì)胞水平原位檢測抗原分子，是其他生物技術(shù)難以達(dá)到和代替的。缺點(diǎn)是易于產(chǎn)生假陽性與假陰性，對于標(biāo)本固定、選擇、干燥、儲存要求比較高。